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单抗制备

北京勤邦生物技术有限公司 2011/3/30 发布人:勤邦生物 浏览次数:3498
    单抗的制备过程是一个让B细胞永生的过程。
    B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
    本部门制备单抗成功的抗原类型多种多样。小分子兽药残留项目一直是主打项目,另外还有大分子免疫球蛋白、病毒、疫苗、孢子、多肽等。
制备过程
  1)免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。
  2)骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
  3)细胞融合的关键:
  1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞无免疫应答。这必然要失败的。
2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。
3骨髓瘤细胞和脾细胞的状态,以及他们的数量比例,还有融合剂本身的质量问题。它们是决定骨髓瘤细胞和脾细胞能否融合在一起的关键因素。
  4)阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
  5)克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
  6)腹水制备与单抗纯化一般采用体内诱生腹水的方法来获得大量单克隆抗体,也可以视具体需要用体外培养的方法来获得大量抗体;单抗的初步纯化一般采用饱和硫酸铵和硫酸-锌酸法进行。
  关于抗体制备的详细内容参见“中国免疫学实验网”。
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